Транскрипция - это процесс синтеза молекулы РНК на участке ДНК , используемом в качестве матрицы. Смысл транскрипции заключается в переносе генетической информации с ДНК на РНК .
Молекула ДНК состоит из двух комплиментарных друг другу цепей, а РНК - только из одной. При транскрипции матрицей для синтеза РНК служит только одна из цепей ДНК. Ее называют смысловой цепью . Исключением является митохондриальная ДНК, в которой обе цепи являются смысловыми и содержат разные гены. Также как исключение на ядерной ДНК некоторые гены могут быть локализованы на несмысловой цепи.
При транскрипции молекула РНК синтезируется в направлении от 5" к 3" концу (что естественно для синтеза всех нуклеиновых кислот), при этом по цепи ДНК синтез идет в обратном направлении: 3"→5".
У эукариот каждый ген транскрибируется отдельно. Исключение опять же представляет митохондриальная ДНК, которая транскибируется на общий мультигенный транскрипт, который затем разрезается. Так как у прокариот гены образуют группы, формируя один оперон, то такие гены транскрибируются вместе. В любом случае транскриптоном называют участок ДНК, состоящий из промотора, транскрибируемого участка и терминатора.
В транскрипции выделяют 3 стадии: инициация, элонгация, терминация .
Инициация транскрипции позволяет начаться синтезу молекулы РНК. Инициация включает присоединение к промотору комплекса ферментов. Главным из них является РНК-полимераза (в данном случае ДНК-зависимая), которая, в свою очередь, состоит из нескольких белков-субъединиц и играет роль катализатора процесса. У эукариот на инициацию транскрипции влияют особые участки ДНК: энхансеры (усиливают) и сайленсеры (подвляют), которые обычно удаленные на некоторое расстояние от самого гена. Существуют различные белковые факторы, влияющие на возможность инициации транскрипции.
У прокариот имеется только один тип РНК-полимеразы, в то время как у эукариот их три. РНК-полимераза-1 используется для синтеза трех видов рибосомальной РНК (всего существует 4 вида рРНК). РНК-полимераза-2 используется для синтеза пре-иРНК (предшественника информационной) РНК. РНК-полимераза-3 синтезирует один из видов рибосомальной РНК, транспортную и малую ядерную.
РНК-полимераза способна распознавать определенные последовательности нуклеотидов и прикрепляется к ним. Эти последовательности короткие и универсальные для всего живого.
После того, как РНК-полимераза присоединяется к промотору, участок двойной спирали ДНК раскручивается и между цепочками этого участка разрываются нуклеотидные связи. Расплетается примерно 18 пар нуклеотидов.
На стадии элонгации происходит последовательное присоединение по принципу комплиментарности свободных нуклеотидов к освобожденному участку ДНК. РНК-полимераза соединяет нуклеотиды в полирибонуклеотидную цепочку.
При синтезе РНК около 12 ее нуклеотидов комплементарно временно связаны с нуклеотидами ДНК. При движении РНК-полимеразы впереди нее цепочки ДНК расходятся, а сзади «сшиваются» с помощью ферментов. Цепь РНК постепенно растет и выдвигается из комплекса РНК-полимеразы.
Существуют элонгирующие факторы, препятствующие преждевременной остановки транскрипции.
Терминация процесса транскрипции происходит в участке-терминаторе, который распознается РНК-полимеразой благодаря специальным белковым факторам терминации.
К 3"-концу синтезированной молекулы РНК присоединяется множество адениновых нуклеотидов (поли-А) для предотвращения ее ферментативного распада. Еще ранее, когда был синтезирован 5"-конец, на нем был образован так называемый кэп .
В большинстве случаев в результате транскрипции не получается готовая РНК. «Сырая» РНК должна еще пройти процесс процессинга , при котором происходят ее модификационные изменения и она становится функционально активной. Каждый тип РНК эукариот подвергается своим модификациям. Формирование поли-А и кэпа часто также относят к процессингу.
IV. ТРАНСКРИПЦИЯ
Транскрипция - первая стадия реализации генетической информации в клетке. В ходе процесса образуются молекулы мРНК, служащие матрицей для синтеза белков, а также транспортные, рибосомальные и другие виды молекул РНК, выполняющие структурные, адапторные и каталитические функции (рис. 4-26).
Рис. 4-26. Схема реализации генетической информации в фенотипические признаки. Реализацию потока информации в клетке можно представить схемой ДНК-"РНК-"белок. ДНК-"РНК обозначает биосинтез молекул РНК (транскрипцию); РНК-"белок означает биосинтез полипептидных цепей (трансляцию).
Транскрипция у эукариотов происходит в ядре. В основе механизма транскрипции лежит тот же структурный.принцип комплементарного спаривания оснований в молекуле РНК (G ≡ C, A=U и Т=А). ДНК служит только матрицей и в ходе транскрипции не изменяется. Рибонукле-озидтрифосфаты (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ) -субстраты и источники энергии, необходимые для протекания полимеразной реакции, образования 3",5"-фосфодиэфирной связи между рибонуклеозидмонофосфатами.
Синтез молекул РНК начинается в определённых последовательностях (сайтах) ДНК, которые называют промоторы, и завершается в терминирующих участках (сайты терминации). Участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации, представляет собой единицу транскрипции -транскриптон. У эукариотов в состав транскриптона, как правило, входит один ген (рис. 4-27), у прокариотов несколько. В каждом транскриптоне присутствует неинформативная зона; она содержит специфические последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют регуляторные транскрипционные факторы.
Транскрипционые факторы - белки, взаимодействующие с определёнными регуляторными сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции. Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах эукариотов составляет в среднем 1:9 (у прокариотов 9:1).
Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК. Разделение ДНК на множество транскриптонов позволяет осуществлять с разной активностью индивидуальное считывание (транскрипцию) разных генов.
В каждом транскриптоне транскрибируется только одна из двух цепей ДНК, которая называетсяматричной, вторая, комплементарная ей цепь, называется кодирующей. Синтез цепи РНК идёт от 5"- к З"-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте (рис. 4-28).
Транскрипция не связана с фазами клеточного цикла; она может ускоряться и замедляться в зависимости от потребности клетки или организма в определённом белке.
РНК-полимеразы
Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК. РНК-полимеразы - олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц - 2α, β, β", σ. Субъединица о (сигма) выполняет регуляторную функцию, это один из факторов инициации транскрипции, РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.
А. Стадии транскрипции
В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.
Инициация
Активация промотора происходит с помощью большого белка - ТАТА-фактора, называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора -ТАТААА- (ТАТА-бокс) (рис. 4-29).
Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение кон-формации РНК-полимеразы и обеспечивают раскручивание примерно одного витка спирали ДНК, т.е. образуется транскрипционная вилка,
Рис. 4-27. Строение транскриптона.
Рис. 4-28. Транскрипция РНК на матричный цепи ДНК. Синтез РНК всегда происходит в направлении 5" → 3".
Рис. 4-29. Строение промотора эукариотов. Промоторные элементы - специфические последовательности нуклеотидов, характерные для любого промотора, связывающего РНК-полимеразу. Первый промоторный элемент - последовательность АТАТАА- (ТАТА-бокс) отделён от сайта начала транскрипции приблизительно на 25 пар нуклеотидов (п.н.). На расстоянии примерно 40 (иногда до 120) п.н. от него располагается последовательность GGCCAATC- (СААТ-бокс).
в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК (рис. 4-30).
После того как синтезирован олигонуклеотид из 8-10 нуклеотидных остатков, σ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, а вместо неё к молекуле фермента присоединяются несколько факторов элонгации.
Элонгация
Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5"- к З"-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной
вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3"- к 5"-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.
Терминация
Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в
Рис. 4-30. Стадии транскрипции. 1 - присоединение ТАТА-фактора к промотору. Чтобы промотор был узнан РНК-полимера-зой, необходимо образование транскрипционного комплекса ТАТА-фактор/ТАТА-бокс (промотор). ТАТА-фактор остаётся связанным с ТАТА-боксом во время транскрипции, это облегчает использование промотора многими молекулами РНК-полимеразы; 2 - образование транскрипционной вилки; 3 - элонгация; 4.- терминация.
строго определенных участках матрицы - терминаторах (сайты терминации). Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта (пре-мРНК), комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.
Б. Ковалентная модификация (процессинг) матричной РНК
Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут использованы в ходе синтеза белка, подвергаются ряду ковалентных модификаций. Эти модификации необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы.
Модификация 5"-конца
Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5"-конца. Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5"-фосфатной группой к 5"-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием 5", 5"-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N 7 -метилгуанозина завершает формирование кэпа (рис. 4-31).
Рис. 4-31. Ковалентная модификация концевых нуклеотидных остатков первичного транскрипта мРНК.
Модифицированный 5"-конец обеспечивает инициацию трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая её от действия 5"-экзонуклеаз в цитоплазме. Кэпирование необходимо для инициации синтеза белка, так как инициирующие триплеты AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп. Наличие кэпа также необходимо для работы сложной ферментной системы, обеспечивающей удаление нитронов.
Модификация 3"-конца
3"-Конец большинства транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-"хвост"), состоящая из 100-200 остатков аде-ниловой кислоты.
Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность -AAUAAA- на растущей цепи РНК. Фермент полиА-полимераза, проявляя экзонуклеазную активность, разрывает 3"-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA-. К 3"-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает по-лиА-"хвост", Наличие полиА-последовательности на 3"-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.
Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.
Сплайсинг первичных транскриптов мРНК
С появлением методов, позволяющих изучать первичную структуру молекул мРНК в цитоплазме и последовательность нуклеотидов кодирующей её геномной ДНК, было установлено, что они не комплементарны, а длина гена в несколько раз больше "зрелой" мРНК. Последовательности нуклеотидов, присутствующие в ДНК, но не входящие в состав зрелой мРНК, были названы некодирующими, или интроны, а последовательности, присутствующие в мРНК, - кодирующими, или экзоны. Таким образом, первичный транскрипт - строго комплементарная матрице нуклеиновая кислота (пре-мРНК), содержащая как экзоны, так и интроны. Длина интронов варьирует от 80 до 1000 нуклеотидов. Последовательности интронов "вырезаются" из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом. Такую модификацию РНК называют "сплайсинг" (от англ, to splice - сращивать). Сплайсинг происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже "зрелая" мРНК.
Гены эукариотов содержат больше интронов, чем экзонов, поэтому очень длинные молекулы пре-мРНК (около 5000 нуклеотидов) после сплайсинга превращаются в более короткие молекулы цитоплазматической мРНК (от 500 до 3000 нуклеотидов).
Процесс "вырезания" интронов протекает при участии малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП). В состав мяРНП входит малая ядерная РНК (мяРНК), нуклеотидная цепь которой связана с белковым остовом, состоящим из нескольких протомеров. В сплайсинге принимают участие различные мяРНП (рис. 4-32).
Нуклеотидные последовательности нитронов функционально неактивны. Но на 5"- и З"-концах они имеют высокоспецифические последовательности - AGGU- и GAGG- соответственно (сайты сплайсинга), которые обеспечивают их удаление из молекулы пре-мРНК. Изменение структуры этих последовательностей влияет на процесс сплайсинга.
На первой стадии процесса мяРНП связываются со специфическими последовательностями первичного транскрипта (сайты сплайсинга), далее к ним присоединяются другие мяРНП. При формировании структуры сплайсосомы 3"-конец одного экзона сближается с 5"-концом следующего экзона. Сплайсосома катализирует реакцию расщепления 3",5"-фосфодиэфирной связи на границе экзона с интроном. Последовательность интрона удаляется, а два экзона соединяются. Образование 3",5"-фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК (малые ядерные РНК), входящие в структуру сплайсосомы. В результате сплайсинга из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы "зрелой" мРНК.
Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов мРНЕ
Для некоторых генов описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же транскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути, поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК и, соответственно, разных белков с одного первичного транскрипта. Так, в парафолликулярных клетках щитовидной железы (рис. 4-33) в ходе транскрипции гена гормона кальцитонина (см. раздел 11) образуется первичный транскрипт мРНК, который состоит из шести экзонов. Матричная РНК кальцитонина образуется путём сплайсинга первых четырёх экзонов (1-4). Последний (четвёртый) экзон содержит сигнал полиаденилирования (последовательность -AAUAAA-), узнаваемый полиА-полимеразой в парафолликулярных клетках щитовидной железы. Этот же первичный транскрипт в клетках головного мозга в ходе другого (альтернативного)
Рис. 4-32. Сплайсинг РНК. В процессе сплайсинга принимают участие различные мяРНП, которые формируют сплайсосому. мяРНП, взаимодействуя с РНК и друг с другом, фиксируют и ориентируют реакционные группы первичного транскрипта. Каталитическая функция сплайсосом обусловлена РНК-составляющими; такие РНК называют рибозимами.
Рис. 4-33. Альтернативный сплайсинг гена кальцитонина. В клетках щитовидной железы сплайсинг первичного транскрипта приводит к образованию кальцитониновои мРНК, включающей 4 экзона и полиА-последовательность, которая образуется после расщепления транскрипта в первом участке сигнала полиаденилирования. В клетках мозга образуется мРНК, содержащая: экзоны 1, 2, 3, 5, 6 и полиА-последовательность, образованную после второго сигнала полиаденилирования.
пути сплайсинга превращается в мРНК кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие. Матричная РНК этого белка состоит из первых трёх экзонов, общих с кальцитониновои мРНК, но включает дополнительно пятый и шестой экзоны, не свойственные мРНК кальцитонина. Шестой экзон тоже имеет сигнал полиаденилирования -AAUAAA-, узнаваемый ферментом полиА-полимеразой в клетках нервной ткани. Выбор одного из путей (альтернативный сплайсинг) и одного из возможных сайтов полиаденилирования играет важную роль в тканеспецифической экспрессии генов.
Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Разные изоформы тропонина образуются в разных тканях на определённых стадиях их развития.
В. Процессинг первичных транскриптов рибосомной РНК и транспортной РНК
Гены, кодирующие большую часть структурных РНК, транскрибируются РНК-полимера-зами I и III. Нуклеиновые кислоты - предшественники рРНК и тРНК - подвергаются в ядре расщеплению и химической модификации (процессингу).
Посттранскрипционные модификации первичного транскрипта тРНК (процессинг тРНК)
Первичный транскрипт тРНК содержит около 100 нуклеотидов, а после процессинга - 70-90 нуклеотидньгх остатков. Посттранскрипционные модификации первичных транскриптов тРНК происходят при участии РНК-аз (рибонуклеаз). Так, формирование 3"-конца тРНК катализирует РНК-аза, представляющая собой 3"-экзонуклеазу, "отрезающую" по одному нук-леотиду, пока не достигнет последовательности -ССА, одинаковой для всех тРНК. Для некоторых тРНК формирование последовательности -ССА на 3"-конце (акцепторный конец) происходит в результате последовательного присоединения этих трёх нуклеотидов. Пре-тРНК содержит всего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон", - триплета нуклеотидов, обеспечивающего взаимодействие тРНК с комплементарным кодоном мРНК в ходе синтеза белков (рис. 4-34).
Посттранскрипционные модификации (процессинг) первичного транскрипта рРНК. Формирование рибосом
В клетках человека содержится около сотни копий гена рРНК, локализованных группами на пяти хромосомах. Гены рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I с образованием идентичных транскриптов. Первичные транскрипты имеют длину около 13 000 нуклеотид-ных остатков (45S рРНК). Прежде чем покинуть ядро в составе рибосомной частицы, молекула 45 S рРНК подвергается процессин-гу, в результате образуется 28S рРНК (около 5000 нуклеотидов), 18S рРНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,88 рРНК (около 160 нуклеотидов), которые являются компонентами рибосом (рис. 4-35). Остальная часть транскрипта разрушается в ядре.
Рис. 4-34. Процессинг пре-тРНК. Определённые азотистые основания нукпеотидов тРНК в ходе процессинга метилируются под действием РНК-метилазы и превращаются, например, в 7-метилгуанозин и 2-метилгуанозин (минорные основания). В молекуле тРНК содержатся и другие необычные основания - псевдоуридин, дигидроуридин, которые также модифицируются во время процессинга.
Рис. 4-35. Образование и выход из ядра субъединиц рибосом. В результате процессинга из молекулы предшественника 45S рРНК образуются три типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5,8S, локализующиеся в большой субъединице. Все три рРНК образуются в равных количествах, так как они происходят из одного и того же первичного транскрипта. 5S рРНК большой субъединицы рибосом транскрибируется отдельно от первичного транскрипта 45S рРНК. Рибосомальные РНК, образованные в ходе посттранскрипционных модификаций, связываются со специфическими белками, и образуется рибосома.
Рибосома - органелла клетки, участвующая в биосинтезе белка. Рибосома эукариотов (80S) состоит из двух, большой и малой, субъединиц: 60S и 40S. Белки рибосом выполняют структурную, регуляторную и каталитическую функции.
Биосинтез РНК – транскрипция – процесс считывания генетической информации с ДНК, при котором нуклеотидная последовательность ДНК кодируется в виде нуклеотидной последовательности РНК. Используется в качестве энергии и субстрата – нуклеозид-3-фосфат с рибозой. В основе лежит принцип комплиментарности – консервативный процесс – синтезируется новая одноцепочная РНК во время всей интерфазы, начинается в определенных участках – промоторах, заканчивается в терминаторах, а участок между ними – оперон (транскриптон) – содержит один или несколько функционально связанных генов, иногда содержит гены которые не кодируют белки. Отличия транскрипции : 1) транскрибируются отдельные гены. 2) не требуется праймера. 3) в РНК включается рибоза, а не дезоксирибоза.
Этапы транскрипции: 1) связывание РНК-полимеразы с ДНК. 2) инициация – образование цепи РНК. 3) элонгация или рост цепи РНК. 4) терминация.
1 этап – участок с которым связывается РНК-полимераза называется промотор (40 нуклеотидных пар) – имеет сайт узнавания, прикрепления, инициации. РНК-полимераза узнав промотора садится на него и образуется закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК спирализовано и комплекс может легко диссоциировать и переходить в открытый промоторный комплекс – связи прочные, азотистое основание выворачивается наружу.
2 этап – инициация синтеза РНК заключается в образовании нескольких звеньев в цепи РНК, синтез начинается на одной цепи ДНК 3’-5’ и идет в направлении 5’-3’. Стадия заканчивается отделением б-субъединицы.
3 этап – элонгация – удлинение цепочки РНК – происходит за счет Core-рРНК-полимеразы. Нить ДНК деспирализована на 18ти парах, а на 12 – гибрид – общий гибрид ДНК и РНК. РНК-полимераза продвигается по цепочке ДНК, а после восстановление цепочки ДНК. У эукариот когда РНК достигает 30 нуклеотидов на 5’-конце образуется защитная структура КЭП.
4 стадия – терминация – происходит на терминаторах. В цепочке находится участок богатый ГЦ, а затем от 4 до 8 расположенных подряд А. После прохождения участка в РНК продукте образуется шпилька и фермент дальше не идет, синтез прекращается. Важную роль играет белковый фактор терминации – ро и тауэр. Пока шел синтез пирофосфат ингибировал ро белок, т.к. фермент остановился (шпилька) прекратился синтез фосфорной кислоты. Ро белок активируется и проявляет нуклеозидфосфатазную активность, что приводит к высвобождению РНК, РНК-полимеразы, которая в дальнейшем объединяется с субчастицей.
Процессинг – созревание РНК. Включает в себя: 1) образование КЭП на 5’-конце, участвует в присоединение к рибосоме. 2) на 3’-конце происходит полиаденилирование и образуется хвост из ста-двухсот адениловых нуклеотидов, он защищает ‘-конец от действия нуклеаз и помогает проходить через ядерные поры и играет роль в присоединение к рибосоме. 3) сплайсинг – вырезается не кодирующие последовательности – интроны. Это происходит двумя путями: а) осуществляется сплайсосомой – это нуклеопротеид, содержащий ряд белков и малую ядерную РНК. В начале происходит выпетливание интронов, при этом остаются только кодирующие последовательности – экзоны. Ферменты эндонуклеазы разрезают, а лигазы сшивают оставшиеся экзоны. Т.О. интроны уходят. Альтернативный сплайсинг – на одной последовательности нуклеиновой кислоты РНК образуют несколько белков. Самосплайсинг – самостоятельное удаление интронов. Нарушение сплайсинга: 1) системная красная волчанка. 2) фенилкетонурия. 3) гемоглобинопатия. Матричная РНК прокариот не подвергается процессингу, т.к. у них не интронов. Процессинг тРНК . Предшественник тРНК расщепляется и отщепляется нуклеотид 5’-3’ Q P. К 3’-концу присоединяется последовательность ССА с ОН-группой, на 5’ конце фосфорилированое пуриновое основание. Дугидроуридиновая петля – АРСаза. Процессинг рРНК. Предшественник рРНК – прорибосомальная РНК 45S синтезируется в ядрышке и подвергается действию рибонуклеаз и образуется 5,8S 18S 28S. Они на 70% спирализуются. рРНК играет роль в формировании рибосомы и участвует в каталитических процессах. Субъединица формируется из рРНК в ядре. Малая субъединица 30S, большая субъединица 50S и образуется рибосома 70S у прокариот, у эукариот 40S + 60S = 80S. Формирование рибосом происходит в цитоплазме.
Участки рибосом для связывания РНК : 1) в малых субъединицах, у которых есть последовательность Шайна-Далгорна мРНК 5’ГГАГГ3’ 3’ЦЦУЦЦ5’. Матричная РНК крепится к малой субъединице. У эукариот КЭП-связывающий участок для мРНК. Участок для связывания с тРНК : а) Р-участок – пептидильный центр для связывания мРНК с растущей пептидной цепью – пептидил-тРНК-связывающий. б) А-участок – для связи тРНК с аминокислотой – аминоацильный участок 2) В большой субъединице Е-участок с пептидилтрансферазной активность.
Обратная транскрипция характерна для ретровирусов или вирусы содержащие РНК – вирус ВИЧ-инфекции, онковирусы.
На цепочке РНК происходит синтез ДНК под действием фермента обратной транскриптазы или ревертазы, или ДНК РНК -полимераза. Внедряясь в клетку хозяина происходит синтез ДНК, в которая встраивается в ДНК хозяина и начинается транскрипция своих РНК и синтез собственных белков.
Генетический код, его характеристика. Генетический код – это нуклеотидная последовательность молекулы рРНК в которой имеются кодовые слова для каждой аминокислоты. Он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК.
Характеристика. 1) генетический код триплетный – т.е. каждая а/к-та зашифрована тремя нуклеотидами. 2) генетический код для а/к является вырожденным или избыточным – подавляющее большинство а/к кодируется несколькими кодонами. Всего 64 триплета образуется, из них 61 триплет кодирует определенную а/к, а три триплета – АУГ, УАА, УГА являются нонсенс-кодонами, т.к. они не кодируют ни одной из 20 а/к, выполняют функцию терминации синтеза. 3) Генетический код является непрерывным, отсутствуют знаки препинания, т.е. сигналы, указывающие на конец одного триплета и начала другого. Код является линейным, однонаправленным, непрерывным. Например - АЦГУЦГАЦЦ. 4) кодоном включения синтеза служит триплет АУГ. 5) Генетический код является универсальным.
22. Трансляция – биосинтез белка. Этапы трансляции: 1) инициация. 2) элонгация. 3) терминация. Инициация – происходит активация а/к.
Инициирующая аатРНК будет взаимодействовать с 1 а/к будущего белка только карбоксильной группой, а 1 а/к может давать на синтез только NH 2 группу, т.о. синтез белка начинается с N-конца.
Сборка инициирующего комплекса на малой субчастице. Факторы: 30S мРНК фомилметионил тРНК IF 123 Mg 2+ ГТФ – источник энергии
Нагруженная факторами инициации малая субъединица находит на мРНК старт кодон АУГ или ГУГ и по нему устанавливается рамка считывания, т.е. старт кодон помещается в Р-участок. К нему подходит формлметионил тРНК, что сопровождается высвобождением фактора IF 3, затем присоединяется большая субъединица и высвобождается IF 1 и IF2, происходит гидролиз 1ГТФ и образуется рибосома. Элонгация – рабочий цикл рибосомы. Включает в себя три шага: 1) связывание аатРНК с А-участком т.к. занят Р-участок– нужны факторы элонгации EF-TU, EF-TS и ГТФ.. 2) транспептидирование Е-участок перебрасывает а/к и образуется пептидная связь. Факторы элонгации у прокариот: EF-TU, EF-TS, EF-G. 3)Транслокация – сначала EF-G деацилированная тРНК Р-участка покидает рибосому, происходит перемещение на 1 триплет в сторону 3’ конца; перемещение пептида из А, в Р-участок – используется ГТФ и фактор элонгации – EF-G-транслоказа, А – участок опять свободен и процесс повторяется. Терминация – узнавание терминирующих кодонов УАА, УГА, УАГ с помощью релизинг-факторов RF 1 2 3. При попадании терминального кодона в А-участок к нему не присоединяется тРНК, а присоединяется один из факторов терминации, который блокирует элонгацию, что сопровождается активацией эстеразной активности пептидилтрансферазы участка Е. Происходит гидролиз сложных эфирных связей между пептидом и тРНК, рибосома покидает пептид, тРНК и диссоциирует на субъединицы, которые потом могут быть использованы.
Формирование структуры происходит одновременно с помощью белков-шаперонов – белки теплового шока. На синтез одной пептидной связи расходуется 1АТФ на аминоацилирование тРНК (присоединение аминокислоты), 1ГТФ на связь аатРНК с А-участком и 1ГТФ на транслокацию. Затрата энергии около 4 макроэргических связей на синтез одной пептидной связи.
23. Лактозный оперон. Регуляция репликации осуществляется с помощью концентрации белка Dna и гуанозинтетрафосфата. Основная регуляция экспрессии генов осуществляется на уровне транскрипции (зависит от стадии развития клетки, всех факторов, действия гормонов и других регуляторных компонентов). В разных клетках тканей только 5% генов экспрессируется, 97% молчат – мусорные ДНК – регуляторы транскрипции это хрономеры и ряд регуляторных последовательностей. Если присоединение белка-регулятора к ДНК вызывает транскрипцию, то это позитивная (+) регуляция, если подавление транскрипции – негативная (-) регуляция. Позитивная регуляция – ген выключен, присоединение белка-регулятора приводит к началу синтеза, в итоге ген включается. Т.О. белок-регулятор может быть индуктором или активатором. Негативная регуляция – ген включен, идет синтез РНК, если присоединяется белковый фактор регуляции (ингибитор или репрессор синтеза белка)Д ген выключается. Многие гормоны и другие факторы влияют на присоединение белка регулятора. Лактозный оперон E. Coli – негативная регуляция. Основные элементы его работы: в молекуле ДНК – участок регулятор, промотор, про-оперон и три структурных гена: лаг 1, лаг 2, лаг 3 и терминатор. Лаг 1 – осуществляет синтез фермента лактазы или бета-галактозидазы. Лаг 2 – фермент пермиаза, участвует в транспорте лактозы через мембрану. Лаг 3 – фермент трансацилаза. Регулятор – синтез мРНК на рибосоме, ведет к образованию белка репрессора, он присоединяется к оператору (т.к. имеет сродство), садится на него, а т.к. участки промотора и оперона перекрываются – РНК-полимераза не может присоединиться к промотору и транскрипция выключается. Глюкоза и галактоза обеспечиваю сходство репрессора и оператора. Если сходства не будет, лактоза взаимодействует с репрессором, меняя его трансформацию, и он не садится на оперон, т.к. теряет сходство к нему. РНК-полимераза садится на промотор и начинается транскрипция матричной РНК. Лактоза – это индуктор, а процесс – индукция – форма негативной регуляции, называемая так потому, что транскрипция прекращается из-за присоединения репрессора и его отщепление приводит к началу синтеза. Позитивная регуляция – ТАТА фактор – имеет сходство к участку ТАТА-бокс. ТАТА фактор садится на ТАТА-бокс – сигнал для РНК-полимеразы для узнавания своего промотора, села на него и начала транскрипцию рядом расположенных генов. У прокариот преоблалает негативная регуляция, для эукариот это не выгодно. Участки-энхансеры (усилители транскрипции) + белок-регулятор приводит к усилению транскрипции. Саинсеры + белок-регулятор à выключает транскрипцию и изменяет структуру хромосом.
Жизнь в углеродной форме существует благодаря наличию белковых молекул. И биосинтез белка в клетке является единственной возможностью для экспрессии гена. Но для реализации этого процесса требуется запуск ряда процессов, связанных с «распаковкой» генетической информации, поиска нужного гена, его считывания и воспроизведения. Термин "транскрипция" в биологии как раз обозначает процесс переноса информации с гена на информационную РНК. Это старт биосинтеза, то есть непосредственной реализации генетической информации.
Хранение генетической информации
В клетках живых организмов генетическая информация локализована в ядре, митохондриях, хлоропластах и плазмидах. В митохондриях и хлоропластах имеется незначительное количество ДНК животных и растений, тогда как плазмиды бактерий являются местом хранения генов, ответственных за быстрое приспособление к окружающим условиям.
В вирусных телах наследственная информация также хранится в виде РНК или ДНК-полимеров. Но процесс ее реализации также связан с необходимостью транскрипции. В биологии этот процесс имеет исключительную важность, так как именно он приводит к реализации наследственной информации, запуская биосинтез белка.
В животных клетках наследственная информация представлена полимером ДНК, который компактно упакован внутри ядра. Потому перед тем синтезом белка или считыванием любого гена должны пройти некоторые этапы: раскручивание конденсированного хроматина и «освобождение» нужного гена, его распознавание ферментными молекулами, транскрипция.
В биологии и биологической химии эти этапы уже изучены. Они приводят к синтезу белка, первичная структура которого была закодирована в считанном гене.
Схема транскрипции в эукариотических клетках
Транскрипция в биологии хоть и изучена недостаточно, но ее последовательность традиционно представляется в виде схемы. Она состоит из инициации, элонгации и терминации. Это значит, что весь процесс делится на три составляющие его явления.
Инициация — это совокупность биологических и биохимических процессов, которые приводят к началу транскрипции. Суть элонгации заключается в продолжении наращивания молекулярной цепочки. Терминация — это совокупность процессов, которые приводят к прекращению синтеза РНК. Кстати, в контексте биосинтеза белка процесс транскрипции в биологии принято отождествлять с синтезом матричной РНК. На основании нее позднее будет синтезирована полипептидная цепочка.
Инициация
Инициация — наименее изученный механизм транскрипции в биологии. Что это с точки зрения биохимии, неизвестно. То есть конкретные ферменты, ответственные за запуск транскрипции, совсем не распознаны. Также неизвестными остаются внутриклеточные сигналы и способы их передачи, которые свидетельствуют о необходимости синтеза нового белка. Для цитологии и биохимии это фундаментальная задача.
Элонгация
Разделить процесс инициации и элонгации во времени пока нельзя из-за невозможности проведения лабораторных исследований, призванных подтвердить наличие специфических ферментов и триггер-факторов. Потому данная граница весьма условная. Суть процесса элонгации сводится к удлинению растущей цепочки, синтезированной на основе матричного участка ДНК.
Считается, что элонгация начинается уже после первой транслокации РНК-полимеразы и начала присоединения первого кадона к стартовому участку РНК. В ходе элонгации на деспирализованном и разделенном на две цепочки участке ДНК происходит считывание кадонов по направлению 3"-5"-цепочки. В это же время растущая цепочка РНК прибавляется новыми нуклеотидами, комплементарными матричному участку ДНК. При этом ДНК «расшивается» на ширину 12 нуклеотидов, то есть на 4 кадона.
Фермент РНК-полимераза движется по растущей цепочке, а «сзади» ее происходит обратное «сшивание» ДНК в двухцепочечную структуру с восстановлением водородных связей между нуклеотидами. Это отчасти отвечает на вопрос о том, какой процесс называется транскрипцией в биологии. Именно элонгация является главной фазой транскрипции, потому как в ее ходе собирается так называемый посредник между геном и синтезом белка.
Терминация
Процесс терминации в транскрипции эукариотических клеток слабо изучен. Пока что ученые сводят его суть к прекращению считывания ДНК у 5"-конца и присоединения группы адениновых оснований к 3"-концу РНК. Последний процесс позволяет стабилизировать химическую структуру полученной РНК. В бактериальных клетках имеется два вида терминации. Это Rho-зависимый и Rho-независимый процесс.
Первый протекает в присутствии Rho-белка и сводится к простому обрыву водородных связей между матричным участком ДНК и синтезированной РНК. Второй, Rho-независимый, происходит после появления стебель-петли, если за ней имеется совокупность урациловых оснований. Эта комбинация приводит к отсоединению РНК от матрицы ДНК. Очевидно, что терминация транскрипции — это ферментативный процесс, однако конкретных его биокатализаторов пока найти не удается.
Вирусная транскрипция
Вирусные тельца не имеют собственной системы биосинтеза белка, а потому не могут размножаться без эксплуатации клеток. Но вирусы имеют свой генетический материал, который нужно реализовывать, а также встраивать в гены зараженных клеток. Для этого они имеют ряд ферментов (или эксплуатируют ферментные системы клетки), которые транскрибируют свою нуклеиновую кислоту. То есть этот фермент на основании генетической информации вируса синтезирует аналог матричной РНК. Но он представляет собой совсем не РНК, а ДНК-полимер, комплементарный генам, например, человека.
Это полностью нарушает традиционные принципы транскрипции в биологии, что следует рассмотреть на примере вируса HIV. Его фермент ревертаза из вирусной РНК способен синтезировать ДНК, комплементарную нуклеиновой кислоте человека. При этом процесс синтеза комплементарной ДНК на основании РНК называется обратной транскрипцией. Это в биологии определение процесса, ответственного за встраивание наследственной информации вируса в геном человека.
Согласно принципу последовательности, информация переносится от ДНК к РНК и белкам: ДНК -> РНК -> белок. В связи с этим обратимся к содержанию транскрипции (от лат. transcriptio - переписывание), наряду с репликацией ДНК являющейся важнейшим генно-молекулярным механизмом. Транскрипция во многом похожа на репликацию, но, разумеется, у нее есть и многочисленные особенности. Одна из них состоит в том, что при выяснении содержания транскрипции непременно необходимо учитывать строение генов. Дело в том, что в репликации воспроизводятся все структурные единицы генов, чего нет при транскрипции.
Традиционно ген определяется как единица наследственной информации, детерминирующая выполнение организмом определенной функции. Ген состоит из регуляторной и кодирующей части. Транскрибируется только кодирующая часть, которая состоит из экзонов и нитронов. Такая транскрипция характерна для незрелой РНК. Она находит свое продолжение в окончательной стадии транскрипции, при которой из незрелой РНК исключаются все интроны, а оставшиеся экзоны объединяются. В месте промотора с регуляторной частью гена связывается РНК-полимераза, которая в результате инициирует начало транскрипции на одной из двух цепей ДНК. На рис. 6.8 представлена схема устройства гена эукариотов, а также зрелой и незрелой РНК.
Некоторые из использованных выше терминов, очевидно, нуждаются в характеристике.
Рис. 6.8.
Промотор (от фраиц. promoteur - основатель, инициатор) - это последовательность нуклеотидов ДНК, которая позволяет регулировать экспрессию генов. Он находится около 5"-гена и, следовательно, непосредственно перед той частью гена, которая кодирует РНК. Существенным признаком промотора является его специфическое взаимодействие с ДНК зависимыми белками, которые посредством РНК-полимеразы определяют начало транскрипции. Такие белки называются факторами транскрипции.
Наряду с промотором к регуляторной части гена относятся последовательности нуклеотидов, которые также оказывают существенное влияние на экспрессию генов. Энхансеры (англ, enhancer - усилитель, увеличитель) ее усиливают, а сайленсеры (от англ, silencer - глушитель) подавляют, но не сами по себе, а лишь в случае воздействия на них факторов транскрипции. Пространственное положение энхансеров и сайленсеров не является четко определенным, они могут находиться на меньшем или большем расстоянии от промотора.
Экзон (англ, expressed region - область выражения) - участок гена, кодирующий зрелую РНК и белки. Экзоны являются первичными генетическими единицами, от которых решающим образом зависит облик всего биологического мира. Именно их перекомбинация приводит к образованию новых генов и белков. Всего лишь 1,5% генного состава ДНК определяет синтез белков. Другая часть этого состава либо вообще не транскрибируется, либо определяет строение таких разновидностей РНК, например транспортных РНК, которые не обладают функцией синтеза белков.
Интрон (от англ, intervening regions - промежуточные области) - участок гена, который не содержит информации о зрелых РНК и белках. Биологические функции интронов изучены значительно хуже, чем функции экзонов. Большие споры вызывает также вопрос об их происхождении: то ли они возникли вместе с прокариотами, то ли вместе с эукариго- тами или же даже позже их. В одном гене человека в среднем содержится 8,8 экзона и 7,8 ингрона, но ингроны в среднем приблизительно в 25 раз длиннее экзонов .
После сказанного нетрудно представить в себе в основных чертах весь процесс транскрипции (рис. 6.9).
Рис. 6.9.
Этап инициации. Под воздействием ферментов, в частности энхансеров, присоединившись к промотору, РНК-полимераза разрывает азотистые основания (указаны на рис. 6.9 вертикальными короткими линиями) и выбирает ту ветвь ДНК, которая становится матрицей транскрипции (на рис. 6.9. это нижняя линия). Она также создает глазок транскрипции (на рис. 6.9. это треугольная крышечка). При этом для этапа элонгации обнажается 10-20 пар неклеотидов. Интересно, что в случае транскрипции нет необходимости в формировании праймера, характерного для процесса репликации ДНК. Транскрипция обходится без праймера.
Этап элонгации. Под действием РНК-полимеразы в области транскрипционного глазка формируется РНК. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза не способна корректировать правильность синтеза РНК-цепи и исправлять допущенные ошибки. Если в процессе синтеза возникают затруднения, то движение РНК-полимеразы приостанавливается. В результате вероятность ошибочной сборки РНК снижается. Транскрипция не прекращается, глазок удаляется от промотера. В тех областях, которые миновал глазок, восстанавливается дуплексная структура ДНК. Цепь синтезируемой РНК постепенно удлиняется. Она растет в направлении 5"-3".
Этап терминации. Он наступает в силу воздействия на РНК-полимеразу вспомогательных факторов. Как только область транскрипции достигается экзонуклеазами, транскрипция прекращается, а РНК-полимераза и РНК отделяются друг от друга. ДНК полностью восстанавливает свою дуплексную структуру.
До сих пор мы рассматривали транскрипцию PI IK в самом общем плане, абстрагируясь от нескольких существенных обстоятельств, в частности, не учитывалось наличие различных типов как РНК, так и РНК-полимераз. Различают следующие типы РНК:
Информация обо всех разновидностях РНК содержится в ДНК. Впрочем, не все они транскрибируются непосредственно на матричной ДНК.
Некоторые РНК являются модификациями ранее транскрибированных РНК. Для нас, знакомящихся с основаниями молекулярной генетики, наибольший интерес представляют РНК, участвующих непосредственно в синтезе белков. Их всего 5 типов (табл. 6.4).
Таблица 6.4
РНК, участвующие в синтеза белков
* Информационная РНК - то же самое, что матричная РНК; ** SPR - сокр. англ. signal recognition particle - частицы, распознающие сигналы.
Транскрипция всех РНК происходит иод действием определенных РНК-полимераз или их сочетаний. В табл. 6.5 приведены основные три типа РНК-полимераз.
Таблица 6.5
Типы РНК-полимераз
’ Малые (короткие) РГК отличаются от длинных РНК. Микро РНК являются разновидностью малых РНК, которые составляют 98% всего рибонуклеотидного материала.
В заключение параграфа отметим, что наряду с прямой транскрипцией возможна и обратная. Способностью транскрибировать РНК в ДНК обладают ретровирусы, в частности ВИЧ, ответственный за СПИД. Ретровирус встраивается в клетку. Специальный фермент обратная транскриптаза осуществляет транскрипцию РНК -» ДНК. Затем на полученной цепи ДНК как на матрице достраивается вторая цепь ДНК. После чего реализуется цикл ДНК -> РНК -» белки. Некоторые эукариоты содержат фермент теломеразу, которая также инициирует обратную транскрипцию. Феномен обратной транскрипции должен учитываться при формулировке принципа последовательности. Он не должен интерпретироваться в качестве отрицания обратной транскрипции.
- Ген состоит из регуляторной и кодирующей части.
- Кодирующая часть гена включает экзоны и нитроны.
- Интроны не транскрибируются в зрелую РНК.
- Транскрипция включает этапы инициации, элонгации и терминации.
- Существуют различные типы и виды как PIIK, так и РИК-полимераз транскрипции.
- Синтез любой РНК осуществляет либо одна, либо несколько полимераз, причем нс без участия белковых ферментов.
- SakharkarM. К., Chow V. Т., Kangueane Р. Distributions of Exons and Introns in the HumanGenome //In Silicio Biology. 2004. Vol. 4. No. 4. P. 387-393.
